mNGS（二代測(cè)序）將顛覆我們?cè)诟腥拘约膊∩系恼J(rèn)知

肺泡灌洗和痰涂片、mNGS結(jié)果均為曲霉菌，痰和肺泡灌洗培養(yǎng)出來的卻是根霉菌，哪個(gè)環(huán)節(jié)出了問題？血mNGS結(jié)果為貓立克次體，序列總數(shù)53152條，而肺泡灌洗卻只有5條支原體？二代測(cè)序結(jié)果為陰道加德納菌，肺泡灌洗測(cè)出70多種細(xì)菌，是操作不當(dāng)還是病人存在嚴(yán)重的衛(wèi)生問題？

以上實(shí)例都是臨床使用mNGS時(shí)出現(xiàn)的問題，浙大一院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科的周華醫(yī)生在中青年呼吸學(xué)者論壇上進(jìn)行了分享，那么，mNGS對(duì)病原學(xué)的診斷與傳統(tǒng)方法相比有什么優(yōu)勢(shì)？mNGS出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性時(shí)，我們?cè)撛趺崔k？為何反復(fù)強(qiáng)調(diào)小心驗(yàn)證的重要性？

感染性疾病診斷的核心難題是「病原診斷」

在開發(fā)出NGS技術(shù)之前，即使用遍所有的方法去診斷感染性疾病，還是會(huì)面臨很多困難，也就是說很多感染性疾病的病人無法及時(shí)精準(zhǔn)診斷病原體，導(dǎo)致治療延誤或者治療不當(dāng)，增加致死率，加重醫(yī)療花費(fèi)。現(xiàn)在應(yīng)用mNGS技術(shù)之后，很多病人還是無法明確病原體，因此我們需要探索新的方法。

目前病原微生物鑒定的檢測(cè)技術(shù)有哪些？

病原學(xué)檢測(cè)方法包括培養(yǎng)和非培養(yǎng)的方法。其中非培養(yǎng)方法包括直接涂片法，多用于細(xì)菌、真菌、 分枝桿菌檢測(cè)；還有抗原/抗體檢測(cè)，很早以前核酸檢測(cè)就應(yīng)用于臨床，以前基于PCR技術(shù)或者多重PCR技術(shù)來做病原體檢測(cè)，隨著二代測(cè)序價(jià)格下降，二代測(cè)序就被用于臨床做感染病人的病原學(xué)診斷。

mNGS對(duì)病原學(xué)診斷與傳統(tǒng)方法相比，具有什么優(yōu)勢(shì)

mNGS指宏基因組二代測(cè)序（Metagenomic Next-generation Sequencing），臨床也稱之為二代測(cè)序、宏基因組測(cè)序、高通量測(cè)序。

宏基因組測(cè)序（Metagenomic Sequencing）對(duì)病原學(xué)診斷與常規(guī)的培養(yǎng)相比具有理論優(yōu)勢(shì)。

優(yōu)勢(shì)是沒有偏移性，比如一個(gè)標(biāo)本中既有曲霉菌又有白色念珠菌，培養(yǎng)時(shí)，如果白色念珠菌生長(zhǎng)較快，便會(huì)影響曲霉菌的生長(zhǎng)，假如一口痰中既有白色念珠菌又有奴卡菌，白色念珠菌生長(zhǎng)有優(yōu)勢(shì)可能影響了奴卡菌的陽(yáng)性率。所以培養(yǎng)是有偏移性的，但理論上說，宏基因組測(cè)序?qū)Σ≡瓕W(xué)診斷沒有偏移性。

優(yōu)勢(shì)是廣覆蓋，對(duì)于常規(guī)的感染性疾病的診斷來說，我們根據(jù)臨床思維，判斷高危因素和病原體，選擇必要的檢測(cè)手段，如果評(píng)估不全面可能導(dǎo)致漏檢。理論上，宏基因組測(cè)序可以沒有偏移的把標(biāo)本中所有病原體的核酸都檢測(cè)出來，所以覆蓋面更廣。

優(yōu)勢(shì)是高效率，可以同時(shí)檢測(cè)多種病原體。

 mNGS診斷方法的優(yōu)勢(shì)：「一網(wǎng)打盡」

類比一下，傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測(cè)方法如同釣魚一樣，需要加上誘餌（引物或抗原抗體），一次只釣一種魚，或者使用多重PCR的方法，放幾個(gè)魚鉤一起釣，一次性釣幾種。而病原宏基因組學(xué)方法學(xué)就如同撒一張大網(wǎng)去全面覆蓋各種病原菌，將可能致病的病原菌一網(wǎng)打盡。

二代測(cè)序除了用于病原學(xué)診斷，還有哪些用途？

二代測(cè)序不僅可以用于病原學(xué)檢測(cè)，也可以在病原培養(yǎng)后做深度的二代測(cè)序，甚至全基因組分析。現(xiàn)在主要用于臨床的還是臨床標(biāo)本病原學(xué)檢測(cè)，通過檢測(cè)可以知道標(biāo)本中含有的病原體。如果測(cè)序量能夠進(jìn)一步突破，它除了可以把標(biāo)本中里所有微生物的核酸測(cè)出來外，也可以把人體表達(dá)的所有RNA測(cè)出來，幫助判斷定植或者感染。比如銅綠假單胞菌測(cè)出來后，人體有沒有針對(duì)它產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，還可以判斷是定植還是感染，但目前還在探索階段，尚常規(guī)未用于臨床。

 mNGS檢測(cè)有幾步？

目前對(duì)于二代測(cè)序來說，給它一個(gè)臨床標(biāo)本，不經(jīng)過培養(yǎng)的話，還是只能用于病原學(xué)診斷。使用二代測(cè)序來做病原學(xué)診斷有六個(gè)基本步驟，一個(gè)是采集感染部位樣本，后一步是報(bào)告解讀，中間有四個(gè)步驟分別為提取核酸、高通量測(cè)序、生物信息分析、檢測(cè)結(jié)果報(bào)告，這四步都不由臨床醫(yī)生操作，由實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員操作完成。其實(shí)我們臨床醫(yī)生要做好一步和后一步，也要了解中間的四步，在報(bào)告解讀的時(shí)候需要了解其中的技術(shù)問題，這樣才能讀懂報(bào)告。